Campo Oscuro

La generación de imágenes confocal implica el escaneo en serie del espécimen para crear secciones ópticas generadas por computadora hasta 250nm de grosor con el uso de luz visible.

Campo Oscuro

TECNOLOGÍA:

La generación de imágenes confocal implica el escaneo en serie del espécimen para crear secciones ópticas generadas por computadora hasta 250nm de grosor con el uso de luz visible. Estas secciones ópticas se pueden apilar para proveer una reconstrucción digital 3-D del espécimen.

Existen diferentes tipos de sistemas de fotón sencillo confocal.

  • El escaneo láser, donde un solo punto enfocado de iluminación láser (punto o grieta) se escanea a través de una muestra en las direcciones X, Y, y Z (alternativamente, pero menos común, el haz de luz es estacionario mientras que la platica del microscopio se mueve a través del haz de luz). Las señales pasan atrás a un detector (fotomultiplicador) a través de una apertura de orificio diminuto (pinhole), que bloquea la luz de otras regiones del espécimen.
  • Sistemas para generación rápida de imagen confocal:
    i. Disco giratorio, donde un disco giratorio (disco Nipkow) con orificios múltiples se inserta entre la fuente de luz y el espécimen. Las señales son recolectadas a través de los mismos orificios que bloquean también la luz fuera de enfoque. La información es recolectada por una cámara CCD.
    ii. Confocal Sweptfield (de barrido de campo) – En lugar de un sistema de disco Nipkow, un sistema Swepfield escanea el espécimen usando una ranura de luz. Los fotones iluminantes pueden también ser enfocados a través de un plato que contiene un diseño lineal de 32 orificios estacionarios de forma que cada punto en el espécimen sea iluminado hasta 260 veces por segundo. Los fotones de emisión son des-escaneados y enfocados en una cámara CCD de alta sensitividad. Debido a que los orificios son estacionarios, el plato que los contiene puede tener diseños de orificios de tamaño diferente, permitiendo la selección del tamaño de orificio óptimo para maximizar tanto la resolución axial como la lateral para la mayoría de los lentes objetivos comúnmente utilizados. Dos tamaños diferentes de ranura satisfacen las demandas de adquisición más rápida, mientras conservan la confocalidad y reducen la fototoxicidad.

APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA:

En imagen confocal, los datos de la imagen son confinados a un plano definido a través del espécimen. Este evita la interferencia de la luz que emana desde arriba y debajo de este plano. La proporción señal a ruido se mejora considerablemente en comparación a las técnicas de campo amplio. La imagen confocal está asociada con más frecuencia a las técnicas de fluorescencia. Esta puede ser usada tanto con los especímenes fijos, como con los vivos.

La imagen confocal de fluorescencia es importante en la generación de imágenes de células vivas, en donde se pueden identificar sondas (o pruebas) múltiples con alta resolución espacial y temporal. Los eventos dinámicos en células se pueden procesar gráficamente con la ayuda de la generación de imágenes deintervalo y se pueden observar en 3-D. Los sistemas de disco giratorio y de barrido de campo (Sweptfield) son ideales para la generación de imágenes de eventos intracelulares de alta velocidad como la dinámica de iones de calcio. La imagen confocal es fundamental para las técnicas avanzadas de generación de imágenes comoFLIMFRETFRAP y FLIP, y se puede usar en asociación con la generación de imágenes TIRF.

CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:

Hay varios sistemas confocales de Nikon desde el nivel de entrada EC1 y el sistema de laboratorio general C1, hasta el C1si de imagen espectral y los sistemas ultramodernos confocales de escaneo láser C1 se pueden montar sobre cualquier microscopio de investigación vertical o invertido. El sistema LiveScan Sweptfield puede ser configurado en el microscopio de la serie TE2000 o, en un futuro cercano, con el sistema de microscopio FN-1.

El sistema confocal de escaneo láser C1 incorpora el intuitivo software EZ-C1 para configurar todos los parámetros de operación. El proceso adicional de datos y el proceso de deconvolución se pueden lograr con un software adicional. El sistema LiveScan Sweptfield incorpora el NIS-Elements para generación de imágenes multidimensional (X, Y, Z, Lambda (longitud de onda), T, punto múltiple)) con soporte para captura, visualización, control de dispositivos periféricos y administración de datos. Ofrece también sofisticadas características de procesamiento de imagen, como un módulo de deconvolución extremadamente poderoso.

Existe un número de objetivos disponible para generación de imágenes de fluorescencia (Plan Fluor, Súper Fluor, Plan Apocromático, Plan Apocromático VC, Apo TIRF). Los objetivos TIRF son ideales para la generación de imagen confocal de célula viva debido a su corrección de temperatura. Los lentes Plan Apocromático VC son ideales para usarse con un láser de diodo de 405, habilitando la imagen cromáticamente correcta desde 400-700nm.

SISTEMA SOLUCIÓN:

Para la investigación de rutina de célula viva, el sistema confocal de escaneo láser C1 en un microscopio invertido de la serie TE2000 con CLEM, PFS e incubadora de control ambiental. Para imágenes avanzadas de célula viva con alta resolución, el ultramoderno sistema confocal LiveScan Sweptfield de Nikon con el microscopio invertido TE2000-PFS con puertos múltiple láser, incubadora de control ambiental y platina Piezo.

ENLACES:

Conceptos fundamentales en microscopía confocal